溶菌酶的制备及其性质

  1.试验器件 1.试验器件 试验 循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器 (500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分搜集器；恒流泵； 圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶 (1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL) 2．试验试剂 试验试剂 ⑴ 鸡蛋清（鲜鸡蛋） ⑵ 底物微球菌粉 ⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂 ⑷ 固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）； 固体磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4） ⑸ 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮 (6) 溶菌酶规范品；Sephadex G50 ⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸

  1．请说出其它提取和纯化溶菌酶的办法吗？请写出相关的办法及原理。 2．根据自己的试验领会，写出优化本试验的办法。

  以及N-乙酰葡萄糖胺所按捺，能被Mg 、Ca （10 ～10 M）、NaCl所激活。 溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内， 鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶 菌酶的大多数来自， 现在， 溶菌酶仍归于紧销的生化物质， 大范围的应用于医学临床， 具有抗感染、 消炎、消肿、增强体内免疫反响等多种药理作用。 溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因 此在别离制备时，先后选用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50 层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。选用福林酚法测蛋白含量，分光光度法 测定酶活性。

  ⑴ 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除掉乙醇，用6g/LNaCl溶液拌和 Sephadex G50数分钟，再抽滤，重复屡次直至无醇味为此。(假如Sephadex G50是新的，则 按试验五中的办法处理凝胶)。参加胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充沛拌和，超声除掉气泡， 装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。 ⑵ 上样：与试验五中的办法相同。 ⑶ 洗脱:样品流完后，先分次参加少数6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，衔接恒流 泵，使流速为0.5mL/min，用部分搜集器搜集，每10分钟一管。 ⑷ 聚乙二醇浓缩：兼并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析 膜外的聚乙二醇，当心取出浓缩液。 ⑸ 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。搜集透析液，量取体积。 5. 溶菌酶生机测定 ⑴ 酶液制造： 精确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶 液，再将酶液稀释成50g/ml. ⑵ 底物制造：取干菌粉5mg加上述缓冲液少量，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟， 倾出，稀释到15～25ml，此刻在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。 5.3 生机测定：先将酶和底物别离放入25 C恒温水浴预热10分钟，汲取底物悬浮液4mL放入 比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后汲取样品液0.2mL（相当于10g 酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时合计下四个读数。 生机单位的界说是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1 个生机单位。 酶的生机单位数=△A450nm/t×0.001 比生机=酶的生机单位数/mg蛋白质 6. 蛋白质含量的测定 选用Folin-酚试剂法进行测定。（拜见试验二） 7. 纯度检测 选用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳办法。（拜见试验六） 8. 理化和酶学性质的测定 学生可根据酶纯化和生机测定的成果， 运用已把握的生化常识和试验技术自行设计的详细计划 进行探究研讨。

  溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有用的抗菌剂，全称为1， 4-β-N-溶菌酶， 又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。 活性中心为天冬氨酸52和谷 氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸 （NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，因为其间含有 较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50 C，最适PH为6～7左右。 该酶活性可被一些金属离子Cu 、 、 （10 ～10 M） Fe Zn 在280nm的消光系数[ A 1% ]为13.0。

  ⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见试验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见试验 二） ⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质

  1.蛋清的制备 1.蛋清的制备 蛋清的制 将4～5个新鲜的鸡蛋两头各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不小于8），悄悄 拌和5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除掉脐带块，量体积约为100ml. 2.鸡蛋清粗别离 2.鸡蛋清粗别离 按过滤好的蛋清量边缓慢拌和边参加等体积的去离子水， 均匀后在不断拌和下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。 3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 ⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH拌和浸泡并 拌和4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述办法 处理树脂，直到悉数转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，坚持过夜，假如pH 之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶 液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。 ⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液， 封闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再参加一些树脂，至树脂堆积至15～20cm 高度即可。 于柱子顶部持续参加pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂， 使流出液pH为6.5 停止，封闭柱子出口，坚持液面高出树脂外表1cm左右。 ⑶ 上柱吸附：将上述蛋清溶液细心直接加到树脂顶部，翻开出口使其缓慢流入柱内， 流速为1ml/min。 ⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在搜集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检 验杂蛋白的洗脱状况，当基线mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，搜集洗脱液。 ⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液兼并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇， 容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏 水洗去透析膜外的聚乙二醇，当心取出浓缩液。 (6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。 4.Sephadex G50分子筛柱层析 4.Sephadex G50分子筛柱层析

  1.溶菌酶 1.溶菌酶 Y 活性检测 ⑴ 酶生机测定办法 ⑵ 酶生机单位界说 ⑶ 比生机界说 ⑷ 蛋白含量测定办法 蛋清溶菌酶 溶菌酶的提取 2. 蛋清溶菌酶的提取 ⑴ 每组4～5个新鲜鸡蛋 ⑵ 使用等电点沉积及树脂层析等办法来进行溶菌酶提取 溶菌酶的别离 的别离、 3. 溶菌酶的别离、纯化 ⑴ 使用许多办法，从上述提取液别离 ⑵ 每步纯化前蛋白纯度检测 ⑶ 别离纯化过程中盯梢检测活性组份的蛋白质含量和酶活性 溶菌酶理化性质 4. 溶菌酶理化性质 ⑴ 溶菌酶的分子量测定 ⑵ 溶菌酶的等电点测定 溶菌酶的酶学性质 5. 溶菌酶的酶学性质 ⑴ 在生机单位界说确认后，求出溶菌酶的Vmax和Km ⑵ 开始确认溶菌酶的最适pH ⑶ 开始确认溶菌酶的最适温度 ⑷ 提出最少两种溶菌酶的可逆按捺剂并验证按捺类型 ⑸ 提出溶菌酶的激活性并验证 (6) 溶菌酶的耐热性