溶菌酶的制备、酶生机和蛋白浓度的测定

  • 1922年的一天，正在伤风的英国细菌学家 Alexander Fleming发现，把一些鼻粘液加 入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而 这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要 物质被认为是一种酶， Fleming命名其为溶 菌酶（ Lysozyme ）。 • 那时，溶菌酶不能证明有临床价值。可是 在酶机制的研究学习方面，溶菌酶扮演了 一个很重要的人物。

  • 本试验首要是以鸡蛋清作为试验资料，采 用D152型树脂柱层析法除掉杂蛋白及等电 点法提取溶菌酶的粗品

  • 鸡蛋清中约含有0.3％的溶菌酶，分子量为14，000，等电 点为11.1，最适溶菌温度为50℃，最适pH值为7。鸡蛋清 溶菌酶化学性质很安稳，当pH值在1.2～11.3范围内剧 烈变化时，其结构仍安稳不变，遇热时该酶也很安稳，在 pH4～7的范围内，100℃处理lmin，仍坚持原酶活性。但 在碱性环境中，该酶对热安稳性较差。其一级结构由129 个氨基酸残基组成的一条多肽链，其安稳性首要与多级结 构中的4对二硫键、氢键及疏水键相互作用。 • 人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。

  取出蛋清，参加1.5倍体积的0.1mol/L磷酸盐缓冲 剂，均匀拌和，将pH值调至8左右，然后用八层 纱布过滤，去滤液，量取体积并记载。

  1、测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液， pH6.2。 2、底物浓度：40mg溶壁微球菌干粉，荣誉100mL测活缓冲 液中。 3、考马斯亮蓝G-250试剂;考马斯亮蓝G-250 100mL 95% 乙醇中，参加100mL 85%盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL, 滤纸过滤。 4、规范蛋白质溶液，用含有0.1mol/L磷酸盐缓冲液， pH7.0(缓冲液A)制造1mg/mL牛血清蛋白溶液。 5、溶菌酶液制造：取上述试验中所取得的溶菌酶粗品液， 荣誉100mL的测活缓冲液。

  • 试验仪器、资料及试剂： （一）仪器：721分光光度计 (二) 资料及试剂： 溶菌酶，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，溶壁 微球菌干粉，氯化钠，考马斯亮蓝G-250, 95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）

  • 溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质聚糖水解酶， 该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁 酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷 键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖 肽，导致细胞壁决裂，使内容物溢出而是 细菌溶解，阻止致病细菌的活性繁衍，并 杀死细菌。

  • 聚乙二醇浓缩：将上诉洗脱液兼并装入透析袋内，至容器 外，外面附以聚乙二醇，容器加盖。酶液中的水分很快就 透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得浓缩液之后的 透析袋用蒸馏水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！当心取的浓 缩版的溶菌酶溶液

  • 与教科书P488页制备办法不同的是：教材 所选用的吸附办法运用磁力拌和器拌和蛋 清液和树脂，自己觉得此办法可以用于样 品较小的状况下，大约在300毫升以下！

  1mol/L NaOH拌和浸泡并拌和4~8h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近 pH7.5左右，抽滤干，再用1mol/L HCl按上述办法处理树脂，知道全 部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/ L NaOH处理树脂，是指转变为 钠型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂 （pH6.5）平衡树脂。 2、装柱：取直径为2.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理 过的上述树脂悬浮液，封闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量的溶 液，再加上一些树脂，至树脂堆积至15~20cm高度即可。与柱子顶部 持续参加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。最终是流出 液pH为6.5停止，封闭柱子出口，坚持页面高出树脂外表1cm。

  棕赤色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，构成蓝 色的复合物最大吸光度由465nm变为595nm。在必定蛋白 浓度范围内，蛋白和染料的结合契合比尔规律。经过测定 595nm处的光吸收值的增加量，可对蛋白质浓度进行定量 测定。

  • 装柱吸附：将上述蛋清液细心参加到树脂顶部，翻开出口 使其缓慢流如注内，流速为1ml/min。 • 去杂蛋白：取出树脂，用柱平衡液洗去树脂上或许有的杂 蛋白。在手机洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检 测杂蛋白的洗脱状况，当基线mol/L NaCl的pH值6.5、浓度为0.02mol/L 磷酸钠缓冲 液洗脱搜集洗脱液！