溶菌酶及其在食品制造业中的应用

  溶菌酶在人乳中含量最高，是牛乳3000倍，是山羊乳的1600倍【4】，是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，在人工喂养或食用母乳不足的婴儿食品中添加溶菌酶是非常必要，将溶菌酶添加至牛乳或其乳制品中，可改良牛乳品质，抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖【5】。因为溶菌酶是人体的一种非特异性免疫因子，对杀死肠道腐败球菌有特殊作用。它能够在一定程度上促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，有利于婴儿消化吸收；它能够在一定程度上促进人工喂养婴儿肠道细菌群的正常化；它能够加强对血清灭菌蛋白，r一球蛋白等体内防御因子，以增加对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻，预防消化器官疾病，增加体重的功效。所以溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉等的良好添加剂。在奶酪生产中使用溶菌酶，特别是中期、长期熟化奶酪中，可以有效的预防奶酪的后期起泡，以及奶酪风味变化，而且不影响在老化过程中的奶酪基液，在半硬干酪中加入0．001％的溶菌酶，可防止香味物质丁酸的损失，同时能阻止由于厌氧孢子增殖体(如酪梭杆菌)的作用所引起的胀气等，这种特性为一般防腐剂不能够达到的【6】。溶菌酶还可用于巴氏杀菌奶，能有效地延长其保存期，由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬时杀菌奶。添加量为300一600ppm，其方法为包装前加入【7】。

  溶菌酶还具有激活血小板的功能。能改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可当作一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。

  溶菌酶在婴儿体内能直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，能够在一定程度上促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化：能够加强血清灭菌蛋白(Properdin)，1一球蛋白(1一globulin)等体内防御因子对感染的抵抗力，特别对早产婴儿有防御体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。

  溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为明显。在机体内它还有抗流感病毒的活性．其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。

  溶菌酶作为机体非特异性免疫因子之一。参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异性免疫中，具有保持机体生理平衡的及其重要的作用。实验表明溶菌酶可改善和增强巨嗜细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能。并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。

  溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中能够找到，也存在于动物组织中，其中以鸡蛋清中含量最多。其它植物组织及微生物细胞中也存在。根据来源不同，其性质及作用机制略有差异。

  鸡蛋清溶菌酶是动物源溶菌酶的典型代表，也是目前研究得最深最透的一类溶菌酶。在鸡蛋清中溶菌酶含量大约2％～4％【3】，等电点在pHl0．8左右，分子量为14000 141，能溶解溶壁小球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌无分解作用。溶菌机理相当复杂，其最适作用温度为50-60C，化学性质很稳定，pH在1．2～11．3之间变化不会影响酶结构太大的改变，遇热该酶也很稳定。pH4～7的范围内，酶在100℃处理lmin仍有近100％的活力，但在碱性环境条件下，酶稳定性较差。鸡蛋清溶菌酶由129个氨基酸组成，维持其稳定性的结构主要由4个二硫键、氢键及疏水键等。有研究表明，其它鸟类蛋清中溶菌酶一级结构亦为129个氨基酸，但氨基酸排列不同且活性部位也有所差异。

  噬菌体产生的溶菌酶。该酶足一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞上不存在该酶。

  溶菌酶是一种葡萄糖苷酶，化学性质稳定，干燥条件下在室温可长期保存，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、。Philips等人用X射线晶体结构分析法分析了溶菌酶的三维结构，溶菌酶分子接近椭圆形，而且构象复杂，a螺旋仅占2 5％，在分子的一些区域有伸展着的p片层结构，研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的，疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到及其重要的作用，其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙。

  溶菌酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌、好气性孢子形成菌等均有良好的抗菌作用，对大肠杆菌、普通变球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有某些特定的程度溶解作用，其最有效浓度为0．05％。溶菌作用的最适pH值为6～7，温度为45～50℃。细菌的细胞壁由胞壁质组成．胞壁质是由N一乙酰氨基葡萄糖(N—acetyIgIucosamine)及N一乙酰胞(Nacetylmuramic acid)交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以接多肽，称为肽聚糖(Peptidoglycan)。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过B—l，4糖苷键相连，肽“尾”则通过D一乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。另外溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N一乙酰胞壁酸(NAM)的l位碳原子和N一乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子问的B一1，4糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解【8】。不管以何种方式作用于细菌，都会使细菌细胞壁出现部分缺失，形成L型细菌而失去对细胞的保护作用，在内部渗透压的作用下，细胞膜破裂，内容物外溢而使细菌溶解死亡【9】。

  当前，我国溶菌酶研究尚处于起步阶段，溶菌酶的高端产品主要被美国、日本等国的大公司所垄断，国内厂家基本上采用从蛋清中提取溶菌酶生产技术，而蛋清溶菌酶有限的溶菌酶及较低的提取率限制了溶菌酶的应用。因此，要积极的极在以下几个方向进行研究：(1)提高产量。酶的生产所带来的成本是其能否在工业上成功应用的关键。运用基因工程技术，结合已有的结构和功能关系的知识，进一步提升酶的产量。减少相关成本【12】。(2)对微生物产的溶菌酶组分进一步分离纯化，研究可能存在的各组分问的协同作用机制【13】。（3)对酶的分子生物学方面的研究，克隆酶的基因，构建高表达工程菌株，进一步研究基因工程菌的发酵动力学，确定发酵动力学参数，找到反映工程菌发酵过程的平衡方程【14】。(4)探讨酶活性位点与保守位点，通过一系列分析酶的一级结构，阐明酶的结构与功能的关系、酶底物的专一性及结构对酶稳定性的影响。(5)对酶的作用机制的探索，弥补当前溶菌机制方面研究的空缺。

  目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，为24000—29 100。1／3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。周泽文(1994)从菜心分离溶菌酶表明。酶比活力达3414．6 U／mg，纯化倍数为197．4。菜心溶菌酶在较宽的温度和pH值范围内均有活性，最适温度为60℃。最适pH值为5．8。高向阳(1997)研究了萝卜溶菌酶对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌3种革兰氏阳性菌，和变形菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、多杀巴斯德氏杆菌、雏白痢沙门氏菌、产气杆菌6种革兰氏阴性菌，及酿酒酵母、总状毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5种真菌的抑菌效果。同时还研究了萝卜溶菌酶对白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌及烟草青枯病菌6种植物病原细菌的抑菌效果。试验证明：萝卜溶菌酶对上述参试的菌种都有不同程度的抑菌作用。

  目前，溶菌酶的开发利用还有许多不足之处。由于溶菌酶主要对革兰氏阳性菌有溶菌作用，而对革兰氏阴性菌的作用较弱【11】；此外溶菌酶作用的特异性高，只对特定的微生物或者微生物的一定生长期起作用；有些溶菌酶虽能分解某些活体细菌，但对该菌的芽胞却不起任何作用；另外，溶菌酶的抑菌活性还要受食品的pH值、温度、盐浓度，向食品中添加溶菌酶的时间、方法和溶菌酶作用的有效条件等因素的影响。并且，人溶菌酶与其它生物溶菌酶在特征序列上存在一定的差别，将溶菌酶直接作为食品防腐剂，尤其是婴儿食品，有一定的风险性，会造成人们对食物的变态反应，但其有良好的配伍性，可与其他添加剂(如同植酸、甘氨酸、聚合磷酸盐等)复配使用，从而大幅度的提升其防腐保鲜的效果和安全性。除此之外，溶菌酶的价格比其他化学杀菌剂高。这些都使得它的应用受到限制。

  溶菌酶(1ysozyrne)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶(murami—dase)，或N一乙酰胞壁质聚糖水解酶(N—acetyl（mummide glyeohydmlas）【1】。1922的某一天，伦敦细菌学家Fleming患了感冒，他无意中把几滴鼻粘液掉在了含有细菌的培养玻片上。过了一些时候，他发现粘液附近的细菌已被解体。这个偶然的现象使他想到粘液中可能含有正在寻找的普遍适用的抗菌物质。通过研究，Fleming揭示，这种抗菌物质是一种酶，并将它命名为lysozyrne(溶菌酶)【2】。

  人们在20世纪60年代发现某些微生物也能产生溶菌酶。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下5种：(1)内N—乙酰己糖胺酶，类似于鸡蛋清溶菌酶，主要破坏细菌细胞壁肽聚糖中的p—1，4糖甘键。(2)酰胺酶，主要作用于细菌细胞壁肽聚糖中N—乙酰胞壁酸(NAM)与肽“尾”之间的N．乙酰胞壁酸—L—丙氨酸键。(3)内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。(4)p．1，3、p—1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，大多数都用在分解酵母细胞的细胞壁。(5)壳多糖酶，这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶。

  溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶，此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一。该酶能催化水解细胞壁中的N一乙酰胞壁酸和N一乙酰氨基葡萄糖胺之间的B一l，4一糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物溢出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下。还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌。此外，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，进而达到消炎、修复组织的目的。

  人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液，以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中，l ml眼泪中含7 mg溶菌酶，l ml乳汁中含0．1—0．5 mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S—S键，分子量为14 600，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。

  对于哺乳动物溶菌酶，目前已从牛、猪、猫、兔、猴、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似。