海洋溶菌酶治疗炎的应用研究

  

  岛大学医学院，山东青岛266021;2.青岛大学医学院附属医院。山东青岛266003)

  〔摘要I目的:探讨海洋溶菌酶的杭菌作用和对大鼠细菌性炎的治疗作用及作用机制.方法:采用海

  洋生物工程制药技术，自海洋牡砺软体中制备海洋溶菌酶.应用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

  法测定海洋溶菌醉和体外对生袍梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)8001、革兰氏阳性(G)细

  菌、革兰氏阴性(G-)细菌的MIC和MBC。复制大鼠细菌性炎病理模型，以分泌物的细菌转阴率

  和粘膜炎症的治愈程度为指标，观察海洋低温溶菌酶对大鼠细菌性炎的治疗作用.透射电镜观

  察海洋溶菌酶的抗菌作用机制。结果:海洋溶菌酶对厌氧菌和真菌具有抗菌作用:对生袍校菌的最低抑

  lag/mL。研究表明，海洋溶菌酶对金黄色荀萄球菌(JP-04-08)株的MBC为。.5mg/mL;对金黄色葫萄

  分别为0.25mg/mL和。.5mg/mL;在复制大鼠细菌性炎的病理模型基础上，研究证明海洋溶菌酶大

  剂量(10mg/kg)、中剂量(5mg/kg)、小剂量(2.5mg/kg)均对大鼠金萄菌和大肠埃希氏菌混合感染

  结论:海洋溶菌酶抗菌语广，对多种革兰氏阳性及阴性菌、厌氧菌和白色念珠菌等均有较强的杭菌作用.

  杭菌作用部位在菌体细胞壁。海洋溶菌酶在2.5-10mg/kg剂量范围内，对大鼠金葡菌和大肠埃希氏菌混

  合感染引起的细菌性炎的治疗作用呈剂量依赖性.治愈程度分别为64.3%,毅15%和92.9%,

  炎性疾病是妇产科的常见病和多发病。目前临床常用治疗药物，主要是化学合成药或是中西药

  物复方制剂。由于临床耐药菌株随抗菌药物应用而上升，自海洋中寻找高效尤其是非抗菌素类且对耐药

  菌有效的药物直接用于临床或作为先导化合物进行结构改造，为21世纪海洋抗菌药物研究的热点。

  溶菌酶，又称细胞壁水解酶，专门作用于细菌细胞壁的骨架物质一肤聚糖，)’一泛存在于高等动植物

  组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中[1-Z1溶菌酶本身是一种蛋白质，最适作用温度为500C,

  在室温下活性较低，仅对革兰氏阳性菌有作用，限制了其应用[3l。近年来国内外已对多种来源的溶菌酶进

  行了广泛的研究，尽管有关微生物所产生的溶菌酶研究较早，但海洋溶菌酶的研究报道较少[41。而具有我

  国自主知识产权的海洋溶菌酶最适作用温度为350C,是一种低温溶菌酶，在pH5.0-9.5之间都有较好的

  稳定性，即在炎症、内pH变化时，更有助于其发挥抗菌作用，因此海洋溶菌酶治疗妇科炎

  海洋溶菌酶由中国水产科学院黄海水产研究所提供，批号:040206,040406;需气菌、厌气菌培养

  基、真菌培养基、营养琼脂由中国生物制品检定所提供:LB液体培养基，为本室配制;洗必泰:西北合

  海洋溶菌酶对白色念珠菌、生抱梭菌最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定(5-.l

  1.4.1.1生抱梭菌悬液的制备将生泡梭菌新鲜培养物，取一白金耳接种于需气菌、厌气菌培养基中，在

  30一350C培养18一24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到适宜的稀释度，取0.1mL以平皿菌落计数

  法进行菌数测定，置30一350C培养48小时，测得生抱梭菌菌落数为15-106

  白色念珠菌菌悬液的制备将白色念珠菌新鲜培养物，取一白金耳接种于线%无菌氯化钠溶液稀释到适宜的稀释度，取O.1mL以平皿菌落计数法进行菌

  最低抑菌浓度(MIC)的测定用适宜的培养基(生抱梭菌用需气菌、厌气菌培养基、白色念珠

  mL(含菌量约为1护CFU/mL)。将生抱梭菌试验管置于30一350C培养24小时，白色念珠菌试

  1.4.1.4最低杀菌浓度(MBC)的测定在测定MIC后，依次将未见细菌生长的各管培养物各吸取0.1mL

  注皿培养，生抱梭菌用需气菌、厌气菌培养基置于30一35℃培养48小时，白色念珠菌用营养琼脂培养基

  置于20-25℃培养48小时，平板上的菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度为最低杀菌浓度。

  海洋溶蔺酶对实验菌株及标准蔺株最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定

  采用二倍稀释法l71，根据预试药物抑菌有效范围将海洋溶菌酶和洗必泰分别在无菌条件下稀释配制

  平皿培养基，备用。选用3种60株细菌 (分别为金黄色葡萄球菌20 株、大肠埃希氏菌20株、肺炎克雷

  伯杆菌20株) 作为实验菌株，选用金黄色葡萄球菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC25923作为标准菌

  同浓度药物的琼脂平皿培养基的表面上，37℃培养18 小时，无细菌生长的平皿中所含药物的最低浓度即

  采用肉汤二倍稀释法测出MIC后，依次将未见细菌生长各管培养物分别吸取0.1 mL倾倒于平皿上，

  370C培养 18 小时，计数平皿上菌落数小于 5 个的最小药物浓度即为最低杀菌浓度 (MBC )a

  较硬棉拭子反复涂擦大鼠内壁15 次，使粘膜机械性损伤，致使棉拭子上粘有少许血性粘液为度，

  然后向大鼠注入金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的棍合菌液，两菌活菌计数分别为4xl护CFU/mL和

  1x104 CFU/mL，注射菌液量为。.2 mU200g，注入部分距口5mm，每日接种一次，共接种3次，每

  日观察大鼠粘膜，并分别在接种首日后的第5天和第7 天取分泌物进行镜检和细菌培养，并作菌

  则，堆积似葡萄状。(2) 血液琼脂平板培养 24 一48 小时，在菌落周围产生溶血环。(3) 血浆凝固酶试验

  产气，靛基质、甲基红、VP、柠檬酸盐试验反应为+ + 一一 (典型大肠埃希氏菌) 或一一一一 〔非典型

  将造模成功的大鼠50 只，分别随机分为 5 组，即海洋溶菌酶大剂娥组、中

  剂量组、小剂量组、洗必泰 (阳性对照) 组、模型组、另取 10 只正常大鼠为空白 〔正常) 对照组。海洋

  型组和空白对照组给温生理盐水冲洗，连续 7 天。停药后第 1, 2, 5 天取大鼠分泌物进行鉴定，3

  次细菌鉴定均为阴性定为转阴。于停药第6 天处死大鼠解剖，取进行肉眼观察。并按表 1 进行评分。

  以模型组的分值为炎症程度100%，给药组与模型组比较，可得出给药组的炎症程度，空白组与给药组炎

  采用NDST 统计软件计算MILS。和MIC9o，同时记录浓度一抑菌百分率曲线 海洋溶菌酶对生抱梭菌、白色念珠菌的作用结果

  海洋溶菌酶对生抱梭菌 (厌氧菌) 和白色念珠菌 〔霉菌) 具有抗菌作用。对生抱梭菌最低抑菌浓度

  采用平皿二倍稀释法，分别测定并计算海洋溶菌酶对临床分离的60 株常见的革兰氏阳性及革兰氏阴

  性菌的体外抗菌作用，结果见表3。研究根据结果得出海洋溶菌酶对临床常见的致病菌均具备比较好的抑菌或杀

  金葡菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌作用较强; 海洋溶菌酶对 G十菌的抗菌作用根据结果得出，对金黄色

  示海洋溶菌酶对2株标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25922 )、大肠埃希氏菌 (ATCC25923 ) 也有较好的

  抑制作用。海洋溶菌酶对细菌的MBC 测定 (表5) 根据结果得出，海洋溶菌酶对金黄色葡萄球菌 (JP-04-08)

  注: +试验管生长; 一试验管未生长; ①最低杀菌浓度; ②最低抑菌浓度

  细菌转阴率是指动物停药后第 .、2, 5 天对大鼠分泌物进行检验确定，3 次细菌鉴定均为阴性或转

  我们在成功建立大鼠细菌性病模型后，根据表 6 结果为，模型组动物在停用温生理盐水冲洗

  1, 2, 5天大鼠分泌物细菌鉴定均为阳性，细菌转阴率为00/n。按人鼠粘膜炎性刺激评分标

  准 (表7 ), 模型组动物大鼠粘膜炎症分值总计为28，其中8/10 的动物为最高分值3, 2/10 的动物为

  分值2，炎症程度为100%a 模型组的动物实验结果证明，成功复制了大鼠金葡菌、大肠埃希氏菌混

  合感染的模型。在成功复制了大鼠金葡菌、大肠埃希氏菌混合感染模型的基础上，分别给药海

  大鼠金葡菌感染的转阴率分别为 80%, 50%, 30%，对大鼠大肠埃希氏菌感染的转阴率分别为

  90%, 60%, 30%。而表8 的结果也显示，海洋溶菌酶大剂量组、中剂量组和小剂量组对细菌棍合感染大

  鼠的治愈程度分别为 92.9%, 82.1%, 64.3%，提示海洋溶菌酶在混合细菌感染的内有较好的抑

  表7 海洋溶菌酶对大鼠混合细菌感染的炎症分值和炎症程度 (n二10)

  注 : (1) 以模型对照组炎症程度为 100% (2) 括号 内为动物数

  溶菌酶，又称细胞壁水解酶，专门作用于细菌细胞壁的骨架物质一肤聚糖，能选择性地分解微生物

  的细胞壁形成溶菌现象，同时不破坏其他组织，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫

  和各种微生物中。近年来国内外己对多种来源的溶菌酶进行了广泛的研究，但未见海洋溶菌酶的研究报

  道。海洋生物牡蜘来源易得、价廉，课题组根据牡蜘解丹毒传统医药理论，就地取材，自海洋生物贝类

  课题组在制定牡砺原料的药学品质衡量准则基础上，采用海洋生物制药技术和自主专利技术，分离纯化海洋

  致病性细菌是引起急性感染的最主耍病原微生物[nol 研究药物的抗菌活性及活性大小，有体外和体

  内两种实验方法。本次研究进行了海洋溶菌酶的体外抗菌试验。测定病原微生物对海洋溶菌酶的敏感性，

  研究中选择药物抑菌试验。本研究分别采取了在肉汤或琼脂平板中将海洋溶菌酶进行一系列二倍稀释后再

  定量接种多种G , G, 厌氧菌和霉菌，孵育后测得的药物抑制检测菌生长的最低浓度称为最低抑菌浓度

  (MIC )，观察海洋溶菌酶对多种 口、G-，厌氧菌和霉菌的 MIC。研究根据结果得出，海洋溶菌酶对临床常

  见的致病菌均有良好的抗菌作用。对金葡菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯杆菌作用较强。海洋溶菌酶对

  控菌株，海洋溶菌酶对质控菌株也有较强的抗菌作用，提示实验中己控制影响体外抗菌试验的可变因素。

  目前国内外常用的定量评价抗菌药物体外杀菌作用的试验是最低杀菌浓度 (MBC) 的测定，该指标

  在新药抗菌药效学评价中具备极其重大意义。由于海洋溶菌酶是海洋创新的抗菌药，因此选择MBC 为研究指

  标，对海洋溶菌酶抗菌药效学进行评价。海洋溶菌酶对3 株细菌的MBC测定根据结果得出，海洋溶菌酶对3

  株细菌的MBC 与MIC较为接近，提示其对实验菌株的抗菌作用为杀菌作用。

  药物的体内抗菌作用研究是采用感染致病菌的动物模型，即模拟临床细菌感染疾病进行抗菌药物实

  验治疗或预防，能更好地反映药物的抗感染疗效和毒性h11。本文首先以Wista: 大鼠为受试动物，选用临

  床分离的感染常见菌: 金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌为感染菌株，复制大鼠金葡菌、大肠埃

  希氏菌混合感染模型。以分泌物的细菌转阴率和粘膜炎性刺激评分标准为指标，评价炎的

  病理模型。细菌转阴率是指动物停药后第 1, 2, 5 天对大鼠分泌物进行检验确定，3 次细菌鉴定均获阴性

  或转阴。模型组动物在停用温生理盐水冲洗后第 1, 2, 5 大大鼠分泌物细菌鉴定均为阳性细菌转阴

  率为0%。按大鼠粘膜炎性刺激评分标准，模型组动物大鼠粘膜炎症分值总计为 28，其中8/10

  的动物为最高分值3, 2/10 的动物为分值2，炎症程度为 100%0 模型组的动物实验结果证明，成功复制

  了大鼠金葡菌、大肠埃希氏菌混合感染的模型。在成功复制了大鼠金葡菌、大肠埃希氏菌混合

  感染模型的基础上，分别给药海洋溶菌酶 10, 5, 2.5 mg/kg, 连续7 天。研究根据结果得出，海洋溶菌

  肠埃希氏菌感染的转阴率分别为 90%, 60%, 30%。对细菌混合感染大鼠炎症的治愈程度分别为

  92.9%, 82.1%, 64.3%，证明海洋溶菌酶在混合细菌感染的内有良好的抗菌作用，且有量一效依赖性。

  生殖道感染是威胁人类生殖健康，特别是妇女身心健康的重要疾病p2-t5[ 我国育龄妇女生殖道感染

  患病率普遍较高，国内报道发病率在20%一70%, 且近年来发病率一直上升P6-}81 海洋溶菌酶为大然非

  抗菌素类抗菌药，作为海洋创新抗菌药因其药学特性决定了，临床细菌性病 (BV) 患者， pH

  发生改变时，也不会影响药物的结构和活性，故海洋溶菌酶通过抗厌氧菌、G十、G等致病菌作用，仍可

  发挥良好的治疗BV 的作用。霉菌性炎主要系自色念珠菌引起。海洋溶菌酶具有抗白色念珠菌作用，

  对肖色念珠菌最低抑菌浓度为。.0625%, 最低杀菌浓度为0.0625%。证明对念珠菌性炎也具有治疗作

  用。根据海洋溶菌酶的体内、外抗菌作用剂量结果提示临床应用海洋溶菌酶治疗 BV和念珠菌性病，

  内局部用药20 mg, 7天为1疗程即可。综上所述，海洋溶菌酶作为具有我国自主知识产权的海洋创

  新药，抗菌谱广，对多种G G, 厌氧菌和白色念珠菌抗菌作用强，为海洋非抗菌素类抗菌药。

  [41周世宁，林永成，姜广策. 海洋微生物的生物活性物质研究[J]. 海洋科学，1997,

  [51 江冰 冯燕 曾维华 等. 喳诺酮类药物对厌氧菌的体夕FWI研究田. 中国抗生素杂志,1999,

  [61 王浴生. 抗菌药物实验法[LA1} 徐叔云，卞如谦，陈修主编. 药理实验方法学[M]. 第三版，北京;人民卫生出版社，2002: