试验十 溶菌酶提取、别离、纯化及生物学性质、理化性质

  ⑴酶液制造：精确称取溶菌酶样品5mg,用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.

  ⑵底物制造：取干菌粉5mg加上述缓冲液少数，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此刻在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。

  学生可根据酶纯化和生机测定的成果，运用已把握的生化常识和试验技术自行设计的详细计划进行探究研讨。

  5.3生机测定：先将酶和底物别离放入25OC恒温水浴预热10分钟，汲取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后汲取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时合计下四个读数。

  生机单位的界说是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个生机单位。

  ⑶D152大孔弱酸性阳离子交换树脂⑷固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4）

  ⑶洗脱:样品流完后，先分次参加少数6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，衔接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分搜集器搜集，每10分钟一管。

  ⑷聚乙二醇浓缩：兼并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，当心取出浓缩液。

  ⑵装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，封闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再参加一些树脂，至树脂堆积至15～20cm高度即可。于柱子顶部持续参加pH6.5,0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5停止，封闭柱子出口，坚持液面高出树脂外表1cm左右。

  溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有用的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，因为其间含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[ ]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2、Fe2、Zn2（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所按捺，能被Mg2、Ca2（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

  ⑺N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸

  ⑻SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见试验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见试验二）

  将4～5个新鲜的鸡蛋两头各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不小于8），悄悄拌和5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除掉脐带块，量体积约为100ml.

  ⑶上柱吸附：将上述蛋清溶液细心直接加到树脂顶部，翻开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。

  ⑷洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在搜集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计查验杂蛋白的洗脱状况，当基线mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，搜集洗脱液。

  按过滤好的蛋清量边缓慢拌和边参加等体积的去离子水，均匀后在不断拌和下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。

  ⑴D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH拌和浸泡并拌和4～8小时，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗至近pH7.5,抽滤干,再用1mol/L HCl按上述办法处理树脂，直到悉数转变成氢型，抽滤干HCl ,用蒸馏水洗致近pH5.5，坚持过夜，假如pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.50.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。

  溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的大多数来自，现在，溶菌酶仍归于紧销的生化物质，大范围的应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反响等多种药理作用。

  溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在别离制备时，先后选用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。选用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。

  ⑸聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液兼并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，当心取出浓缩液。

  ⑴装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除掉乙醇，用6g/LNaCl溶液拌和Sephadex G50数分钟，再抽滤，重复屡次直至无醇味为此。(假如Sephadex G50是新的，则按试验五中的办法处理凝胶)。参加胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充沛拌和，超声除掉气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。

  循环水式真空泵HSB-IⅡ;蛋白紫外检测仪;记录仪;紫外分光光度计;梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计;冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分搜集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)